Redigert av Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, godkjent 25. desember 2020 (anmeldt 25. oktober 2020)
Vi rapporterer interaksjonen mellom underenheter i replikasjonen av koronavirus-transkripsjonskomplekser, som er avgjørende for replikasjon og evolusjonær bevaring.Vi ga bevis for at NiRAN-domenet assosiert med nsp12 har nukleosidmonofosfat (NMP) transferaseaktivitet i trans, og identifiserte nsp9 (et RNA-bindende protein) som sitt mål.NiRAN katalyserer den kovalente bindingen av NMP-delen til den konserverte nsp9-aminoterminalen i en reaksjon som er avhengig av Mn2+-ioner og tilstøtende konserverte Asn-rester.Det ble funnet at NiRAN-aktivitet og nsp9 NMPylering er avgjørende for replikering av koronavirus.Dataene tillater oss å koble denne aktiviteten til den nestede virusenzymmarkøren til de tidligere observasjonene i hypotesen om at initieringen av RNA-syntese i en klasse av RNA-virus er funksjonelt og evolusjonært konsistent.
Den RNA-avhengige RNA-polymerasen (RdRps) til Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae og 12 andre familier) er knyttet til det aminoterminale (N-terminale) domenet i det ikke-strukturelle proteinet (nsp) frigjort fra polyproteinet, kalt NiRAN 1ab er sammensatt av viral hovedprotease (Mpro).Tidligere ble det arterielle viruset NiRAN-RdRp nsps egen GMPylerings/UMPyleringsaktivitet rapportert, og det ble foreslått å generere en forbigående for overføring av nukleosidmonofosfat (NMP) til (foreløpig ukjent) virus og/eller cellebiopolymerisering.Her viser vi at koronaviruset (Human Coronavirus [HCoV]-229E og alvorlig akutt respiratorisk syndrom Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) har Mn2+-avhengig NMPyleringsaktivitet, som er avledet fra nsp9 gjennom dannelsen av Mpro-mediert nsp9 etter den N-terminale flankerende nsps frigjøres proteolytisk, fosforamidatet er bundet til det primære aminet (N3825) ved N-terminalen til nsp9.Uridintrifosfat er det foretrukne nukleotidet i denne reaksjonen, men adenosintrifosfat, guanosintrifosfat og cytidintrifosfat er også egnede kosubstrater.Mutasjonsstudier ved bruk av rekombinante coronavirus nsp9 og nsp12 proteiner og genetisk konstruerte HCoV-229E mutanter bestemte restene som var nødvendige for NiRAN-mediert nsp9 NMPylering og virusreplikasjon i cellekultur.Dataene bekreftet forutsigelsen av NiRAN-rester av aktive steder og bestemte den viktige rollen til nsp9 N3826-rester i nsp9 NMPylering og virusreplikasjon in vitro.Denne resten er en del av den konserverte N-terminale NNE-tripeptidsekvensen og viste seg å være den eneste invariante resten av nsp9 og dens homologer i coronavirus-familien.Denne studien gir et solid grunnlag for den funksjonelle studien av NMPyleringsaktivitet til andre nestede virus og foreslår mulige mål for utvikling av antivirale legemidler.
Nidovirales positivt-trådet RNA-virus infiserer en rekke virveldyr og virvelløse dyr (1, 2).Ordren omfatter i dag 14 familier (3), hvorav koronavirusfamilien har blitt grundig studert de siste 20 årene.På den tiden dukket det opp tre zoonotiske koronavirus fra dyreverter og forårsaket storskala utbrudd av alvorlige luftveisinfeksjoner hos mennesker.Inkludert vedvarende pandemier forårsaket av alvorlige akutte infeksjonssykdommer.Respiratorisk syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidovirus deler en felles genomorganisasjon, og underenheten til det membranbundne replikasjons-transkripsjonskomplekset (RTC) er kodet i de 5-?²-terminale to tredjedelene og den strukturelle hovedunderenheten til viruspartikkelen, samt noe tilbehør. .Protein, kodet i den 3??² ende tredjedelen av genomet (1).Bortsett fra én familie av planarvirus (Monoviridae) (8), koder alle nestede virus for RTC-underenheter i to store åpne leserammer (ORF) ORF1a og ORF1b, som er oversatt fra genomisk RNA av.ORF1a koder for polyprotein (pp) 1a, og ORF1a og ORF1b koder sammen for pp1ab.Med den generelle deltakelsen av hovedproteasen (Mpro) kodet av ORF1a, blir både pp1a og pp1ab proteolytisk prosessert til en rekke ikke-strukturelle proteiner (nsps), også kjent som 3CLpro, fordi den har homologi med 3Cpro av picornaviruset ( 9).Disse nsp-ene antas å være satt sammen til en stor dynamisk RTC, katalyserer syntesen av genomisk RNA (replikasjon) og et sett med subgenomisk RNA (transkripsjon), og brukes til å koordinere uttrykket av ORF lokalisert nedstrøms for ORF1b (10? ? ?12).
Kjerne-RTC inkluderer RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp) (13), superfamilie 1-helikase (HEL1) (14, 15) og flere RNA-prosesseringsenzymer, som hovedsakelig er kodet i ORF1b og i koronavirusfamilien. Den inneholder nsp12-nsp16 og nsp9-nsp12 i Arterioviridae-familien (se referanse 10âââ 12).RdRp og HEL1 representerer to (en femtedel) konserverte domener av fuglereirviruset og har homologi blant andre RNA-virus.Kjernereplikase antas å være assistert av andre underenheter, inkludert flere små nsps frigjort fra den karboksyterminale (C-terminale) regionen til pp1a, nedstrøms for Mpro (henholdsvis koronavirus nsp5 og arterielt virus nsp4).De har begrenset familiespesifikk beskyttelse og ulike aktiviteter (gjennomgått i referanse 10ââ12).
Relativt nylig ble det funnet et domene med unike sekvensmotivegenskaper ved aminoterminalen (N-terminalen) ved siden av RdRp i alle nestede virus, men ingen andre RNA-virus (16).Basert på dets lokalisering og nukleotidtransferase (nukleosidmonofosfat [NMP] transferase) aktivitet, heter dette domenet NiRAN (Nestvirus RdRp-relatert nukleotidtransferase).Dobbeltdomenekombinasjonen av NiRAN-RdRp utgjør nsp12 i Coronaviridae-familien og nsp9 i Arterioviridae-familien, og i andre nestoviridae forventes NiRAN-RdRp å bli frigitt som en uavhengig nsp fra det virale polyproteinet.I koronaviruset inneholder NiRAN-domenet ??1/450 rester og er koblet til det C-terminale RdRp-domenet gjennom linkerregionen (16?19).I Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), viser rekombinant nsp9 Mn2+ ioneavhengige (selv) UMPylerings- og GMPyleringsaktiviteter, som er avhengige av tre konserverte sekvensbaser i nestovirus, AN, BN og CN Residiene i sekvensen.Hvor N står for NiRAN) (16).Den N-terminale flankeringen av disse motivene er et mindre konservativt motiv preAN.Noen av disse restene er også konservert i fjernt beslektede proteinkinaser, hvor de har vist seg å være involvert i nukleosidtrifosfat (NTP)-binding og katalytisk aktivitet (20, 21).I samsvar med denne observasjonen kan flere nøkkelaktive steder i pseudokinase SelO fra Pseudomonas syringae settes sammen med det nylig publiserte SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkomplekset.Bevarte koronavirus NiRAN-rester overlagret i elektronmikrostrukturen.Rekombinant protein (17).Det spekuleres i at den dokumenterte (selv) U/GMPyleringen vil produsere en forbigående tilstand for å overføre NMP til det (foreløpig ukjente) substratet (16), og den strukturelle likheten mellom NiRAN og proteinkinase (17, 19) ) Er hypotesen at NiRAN modifiserer andre proteiner.
Mange funksjoner, inkludert dens unike og unike systematiske assosiasjon med nestede virus og genetisk separasjon fra RdRp, gjør NiRAN til et rimelig nøkkelregulatorisk enzym for nestede virus, som er avgjørende for deres fremvekst og identitet.Tidligere ble tre mulige funksjoner som involverte NiRAN for å regulere genom/subgenomisk translasjon eller replikasjon/transkripsjon kalt.Når man vurderer de knappe og ufullstendige dataene som er tilgjengelige på det tidspunktet, har hver funksjon sine fordeler og ulemper (16).I denne forskningen tar vi sikte på å kombinere de biokjemiske og omvendt genetiske studiene av koronavirusene som representerer de to slektene, og sette funnene våre i den evolusjonære bakgrunnen for den naturlige mutasjonen av koronavirusfamilien, for å få innsikt i dette mystiske riket.Vi rapporterer store fremskritt i forståelsen av NiRAN gjennom identifisering av naturlige mål i RTC, som (blant de tre tilgjengelige hypotesene) bidrar til rollen til dette domenet i å initiere syntesen av nestet virus-RNA.Denne forskningen åpner også for muligheter for andre roller til NiRAN på virusvertsgrensesnittet.
For å karakterisere de enzymatiske egenskapene til det koronavirus nsp12-relaterte NiRAN-domenet, produserte vi en rekombinant form av humant coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 i E. coli, med en His6-tag ved C-terminalen, og kombinerte protein med [α32-P ] Inkuber sammen med NTP i nærvær av MnCl2 som beskrevet i Materialer og metoder.Analysen av reaksjonsproduktet indikerte tilstedeværelsen av et radiomerket protein som migrerte sammen med nsp12 (106 kDa), noe som indikerer at coronavirus nsp12 katalyserer dannelsen av kovalente protein-NMP-addukter, fortrinnsvis dannet med uridinmonofosfat (UMP) (Figur 1A) og B).Kvantitativ analyse viste at sammenlignet med andre nukleotider, økte signalintensiteten til UMP-inkorporering med 2 til 3 ganger (figur 1C).Disse dataene er i samsvar med den forutsagte NMP-transferaseaktiviteten til NiRAN-domenet til koronaviruset (16), men indikerer at nukleotidpreferansene til NiRAN-domenet til koronaviruset og det arterielle viruset er forskjellige.
Selv-NMPyleringsaktivitet av HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ble inkubert med den angitte [α-32P] NTP i nærvær av 6 mM MnCl2 i 30 minutter (se Materialer og metoder for detaljer).Reaksjonsproduktene ble separert ved SDS-PAGE og farget med Coomassie brilliant blue.(B) Det radiomerkede proteinet visualiseres ved fosforavbildning.Posisjonene til nsp12-His6 og proteinmolekylmassemarkører (i kilodalton) er vist i A og B. (C) Intensiteten til det radioaktive signalet (gjennomsnitt ± SEM) ble bestemt fra tre uavhengige eksperimenter.*P≤0,05.Signalstyrken (prosent) er relatert til UTP.
Selv om NiRAN-relaterte enzymaktiviteter har vist seg å være avgjørende for replikering av EAV og SARS-CoV i cellekultur (16), er den spesifikke NiRAN-funksjonen og potensielle mål ennå ikke bestemt.Den nylig rapporterte strukturelle likheten mellom NiRAN og en familie av proteiner med proteinkinase-lignende folder (17, 22) fikk oss til å teste hypotesen om at NiRAN katalyserer NMPylering av andre proteiner.Vi genererte et sett med potensielle homologe mål, inkludert ikke-strukturelle proteiner kodet av HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), som hver inneholder en C-terminal His6 tag (SI vedlegg, tabell S1), og inkuber disse proteinene med [α32-P] uridintrifosfat ([α32-P]UTP) i nærvær eller fravær av nsp12.Bovint serumalbumin og MBP-LacZα-fusjonsprotein produsert i E. coli tjente som kontroller (figur 2A, felt 1 til 7).Det radiomerkede proteinet ble analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og autoradiografi, og det ble funnet at det var et sterkt radioaktivt signal i reaksjonen inneholdende nsp12 og nsp9.Posisjonen til signalet tilsvarer molekylmassen til nsp9, noe som indikerer nsp12-mediert UMPylering av nsp9 (figur 2B, spor 7).Ingen andre testproteiner ble funnet å være UMPylerte, noe som førte til at vi konkluderte med at nsp9 er et spesifikt substrat for nsp12.I samsvar med selv-NMPyleringsdataene vist i figur 1, er nsp12 i stand til å overføre alle fire NMP-er til nsp9, selv om effektiviteten er forskjellig, UMP> adenosinmonofosfat (AMP)> guanosinmonofosfat (GMP)> cytidinmonofosfat (CMP) ) ( Bilde).3 A og B).Under forholdene brukt i denne analysen (forkort reaksjons- og eksponeringstiden, reduser konsentrasjonen av nsp12; materialer og metoder), kunne ikke selv-NMPyleringen av nsp12 påvises (sammenlign figur 2B, bane 7 og figur 1B), som viste seg å være en effektiv (Og flere runder) UMP flyttet fra nsp12 til nsp9.UMP-transferaseaktivitet krever tilstedeværelse av Mn2+-ioner, som vist i figur 3C, mens bare minimal UMP-transferaseaktivitet ble observert i nærvær av Mg2+, og ingen aktivitet i nærvær av de to andre divalente kationene som ble testet.Lignende data ble oppnådd i NMPyleringsanalyser som inneholder cytidintrifosfat (CTP), guanosintrifosfat (GTP) og adenosintrifosfat (ATP) (SI vedlegg, figur S1).
HCoV-229E nsp12-mediert UMPylering av nsp9.En serie proteinsubstrater (inkludert bovint serumalbumin, MBP-lacZα og en serie HCoV-229E nsps merket med C-terminal His6 kodet av ORF1a) ble brukt for å evaluere UMPyleringsaktiviteten til HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediert protein.Inkuber proteinet med [α-32P] UTP i 10 minutter i fravær (A) eller nærvær (B) av nsp12 som beskrevet i materialene og metodene.På toppen av A og B vises SDS-polyakrylamidgel farget med Coomassie Brilliant Blue, og nederst på A og B vises de tilsvarende autoradiogrammene.Plasseringen av proteinmolekylmassemarkøren (i kilodalton) er gitt til venstre.Posisjonen til nsp12-His6 (B, topp) og det radioaktive signalet observert under inkubasjonen av nsp12-His6 med nsp9-His6 (B, bane 7) er også indikert, noe som indikerer at [α-32P]UMP til nsp9-His6 (12,9 kDa), som ikke ble observert for andre testede proteiner.
HCoV-229E NiRAN-mediert biokjemisk og virologisk karakterisering av nsp9 NMPylering.(A og B) Rollen til nukleotid-co-substratet som brukes i reaksjonen.Nsp12-His6 og nsp9-His6 blandes og inkuberes i nærvær av forskjellige [α-32P] NTP-er i standard NMPyleringsanalyse.(A, øverst) Coomassie-farget nsp9-His6 atskilt med SDS-PAGE.(A, nederst) Autoradiograf av samme område av gelen.(B) Den relative aktiviteten (gjennomsnitt ± SEM) i nærvær av den angitte nukleotid-kofaktoren bestemmes fra tre uavhengige eksperimenter.*P≤0,05.(C) Rollen til metallioner.Vist er standard NMPyleringstest i nærvær av [α-32P] UTP og forskjellige metallioner, hver med en konsentrasjon på 1 mM.I C vises den øverste, Coomassie-farget nsp9-His6, og i C, bunnen, vises den tilsvarende autoradiografien.Størrelsen på det merkede proteinet (i kilodalton) er vist til venstre for A og C. (D) Mutantformen av HCoV-229E nsp12-His6 som bærer den spesifiserte aminosyresubstitusjonen er i [α-32P]UTP, som beskrevet i materialer og metoder.Den radiomerkede nsp9-His6 produsert i NMPyleringsreaksjonen påvises ved fosforyleringsavbildning (D, øverst).Den relative aktiviteten sammenlignet med villtype (wt) proteinet er vist i D, og bunnen er tatt som gjennomsnittet (±SEM) fra tre uavhengige eksperimenter.Stjerner indikerer substitusjoner av ikke-konserverte rester.(E) Virustiteren i kultursupernatanten av p1-celler oppnådd 24 timer etter infeksjon ble bestemt ved plakkanalyse.Kodonsubstitusjonene i NiRAN-domenet til den konstruerte HCoV-229E-mutanten er indikert (restnummerering er basert på deres posisjon i pp1ab).Den replikasjonsmangelfulle RdRp aktive sete-mutanten nsp12_DD4823/4AA ble brukt som en kontroll.
For å få en dypere forståelse av det aktive stedet til NiRAN og bestemme restene relatert til aktiviteten til nsp9-spesifikk NMP-transferase, utførte vi mutasjonsanalyse, der vi erstattet de konservative restene i NiRAN AN-, BN- og CN-motivene ( 16) Det er Ala (SI vedlegg, figur S2).I tillegg ble virkningen av konservative Arg-til-Lys- eller Lys-til-Arg-substitusjoner evaluert i to tilfeller.Som en (negativ) kontroll erstattes rester som ikke eller mindre er bevart i NiRAN-domenet til koronavirus og andre nestede virus med Ala. Erstatter K4116A (i motiv preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) og D4280A (CN) reduserer eller til og med eliminerer nsp9 NMPylering gjennom nsp12, mens proteiner med konservative substitusjoner (R4178K), K4116R) beholder 60 % og 80 % av aktiviteten, noe som indikerer at reduksjonen av restriksjonene på deres respektive side kjeder er fysisk-kjemisk følsomme (figur 3D).Å erstatte flere andre konserverte rester E4145A, D4273A, F4281A og D4283A er mye mindre skadelig, og nsp9 UMPylering er bare moderat redusert.Lignende resultater ble oppnådd i nsp9 NMPyleringsreaksjoner som involverte andre NTP-er (figur 3D og SI-vedlegg, figur S3), som bekrefter at de observerte effektene på spesifikke aminosyresubstitusjoner er uavhengige av typen nukleotid-co-substrat som brukes.Deretter testet vi den mulige innvirkningen av disse nsp12-substitusjonene på replikasjonen av koronavirus i cellekultur.For dette formål brukte vi passende genetisk konstruerte komplementære DNA (cDNA) maler klonet i rekombinant vacciniavirus (23, 24) for å transkribere 5-7 celler.Titrering av infeksiøst virusavkom produsert i disse cellene viste at de fleste HCoV-229E NiRAN-mutanter ikke var gjennomførbare (figur 3E).En gruppe ikke-levedyktige virale mutanter inkluderer alternativer som har vist seg å eliminere eller signifikant redusere NMP-transferaseaktivitet in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), men det er to andre alternativer (K4116R, E4145A) % forbeholdt?Deres in vitro NMPyleringsaktivitet antyder at ytterligere restriksjoner er involvert.Tilsvarende produserte to andre mutasjoner (R4178K, F4281A) som forårsaket en moderat reduksjon i NiRANs in vitro NMPyleringsaktivitet levende virus, men disse virusene reduserte titere betydelig gjennom replikasjon.I samsvar med in vitro-aktivitetsdataene vist i figur 3D, erstatter fire andre rester som ikke er bevart i koronavirus og/eller andre nestede virus (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produserte levedyktige virus. Avkommet, til tross for at de hadde en moderat redusert titer sammenlignet med villtypeviruset (figur 3E).
For å studere om NiRAN-mediert NMP-transferaseaktivitet avhenger av det aktive RdRp-domenet, ble de to konserverte Asp-restene involvert i koordineringen av toverdige metallioner (11) i RdRp-motiv C erstattet av Ala. Det resulterende proteinet nsp12_DD4823/4AA beholder dens nsp9 NMPyleringsaktivitet, noe som indikerer at nsp12-mediert in vitro nsp9 NMPyleringsaktivitet ikke krever polymeraseaktivitet (SI vedlegg, figur S4).
Etter å ha etablert den nsp9-spesifikke NMP-transferaseaktiviteten for nsp12, prøvde vi å karakterisere NMP-nsp9-adduktet ved massespektrometri (MS).Det komplette proteinmassespekteret til rekombinant HCoV-229E nsp9 viste en topp ved 12 045 Da (figur 4A).Tilsetningen av nsp12 endret ikke kvaliteten på nsp9, noe som indikerer at nsp12 og nsp9 ikke ville danne et stabilt kompleks under forholdene som ble brukt (denaturering) (figur 4A).I nærvær av UTP og GTP viste massemålingen av reaksjonen som inneholdt henholdsvis nsp9 og nsp12 at proteinmassen til UTP beveget seg 306 Da, og proteinmassen til GTP beveget seg 345 Da, noe som indikerer at hvert nsp9-molekyl binder en UMP eller GMP (Bilde 4) C og D).Det spekuleres i at energien som kreves for NiRAN-mediert nsp9 NMPylering kommer fra NTP-hydrolyse og pyrofosfatfrigjøring.Selv om et 10 ganger molart overskudd av nsp9 (mål) enn nsp12 (enzym) ble brukt i denne reaksjonen, ble nesten fullstendig NMPylering av nsp9 observert, noe som indikerer at interaksjonen mellom nsp12 og nsp9 er kortvarig, og nsp12 kan NMPylere mer nsp9 in vitro molekyl.
Enkel NMPylering av nsp9 i nærvær av nsp12 og UTP eller GTP.Vist er det dekonvoluterte komplette proteinmassespekteret til HCoV-229E nsp9 (SI vedlegg, tabell S1) (AD).(A) nsp9 alene, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 i nærvær av UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 i nærvær av GTP.
For å bestemme nsp9-restene UMPylert av nsp12, ble nsp9-UMP spaltet med trypsin.De resulterende peptidene ble separert ved hjelp av nano-høy ytelse væskekromatografi (HPLC) og analysert ved tandem massespektrometri (MS/MS) online.Dataanalyse ved bruk av Byonic-programvarepakken (Protein Metrics) viste UMPylering av den N-terminale aminosyren.Dette bekreftes manuelt.Tandemmassespekteret til forløperpeptidet [UMP]NNEIMPGK (SI vedlegg, figur S5A) avslørte et fragment ved 421 m/z, noe som indikerer at UMP binder seg til rest 1 av nsp9.
Ved N-terminalen av nsp9 er Asn bevart blant medlemmene av Orthocoronavirinae (SI vedlegg, figur S6).Selv om vi tror at det N-terminale primære aminnitrogenet er den mest sannsynlige akseptoren for UMP, bestemte vi oss for å skaffe ytterligere bevis på NMP-binding ved N-terminalen.Av denne grunn ble det ikke-NMPylerte og NMPylerte N-terminale peptidet nsp9 renset ved HPLC avledet i nærvær av aceton og natriumcyanoborhydrid.Under disse forholdene kan bare frie primære aminer modifiseres med propyl (25).Det N-terminale nsp9-avledede peptidet med sekvensen NNEIMPGK inneholder to primære aminer, en ved N-terminalen til Asn og den andre ved sidekjeden til Lys ved C-terminalen.Derfor kan propylgrupper innføres i begge ender.De ekstraherte ionekromatogrammene av ikke-NMPylerte peptider er vist i SI-vedlegget, figur S5B.Som forventet kan N-terminale og C-terminale (mono)propylerte (SI vedlegg, figur S5B, øvre bane) og dipropylerte peptider (SI vedlegg, figur S5B, nedre bane) identifiseres.Dette mønsteret endres ved bruk av det NMPylerte N-terminale peptidet til nsp9.I dette tilfellet kan bare C-terminale propylerte peptider identifiseres, men N-terminale propylerte peptider og dipropylerte peptider identifiseres ikke (SI-vedlegg, figur S5C), noe som indikerer at UMP har blitt overført til det N-terminale primære aminet. For å forhindre dette gruppe fra å gjøre endringer.
Deretter erstatter vi (med Ala eller Ser) eller sletter de konserverte restene ved N-terminalen av nsp9 for å definere målspesifikke begrensninger.Basert på MS-dataene våre som viser at NiRAN danner et nsp9-NMP-addukt med det primære aminet til den N-terminale resten av nsp9, antok vi at nsp9 NMPylering krever den virale masterproteasen (Mpro, nsp5) for å frigjøre nsp9 N-terminalen fra dets polyproteinforløper.For å teste denne hypotesen produserte vi et forløperprotein nsp7-11 som inneholder nsp9 i E. coli og utførte en standard NMPyleringstest i nærvær av [α-32P] UTP (materialer og metoder).Som vist i figur 5A (bane 3), er den ukuttede nsp7-11-forløperen ikke radiomerket med nsp12.I motsetning til dette, hvis nsp7-11 spaltes av rekombinant nsp5 for å frigjøre nsp9 (og andre nsps) fra forløperen, oppdages et radiomerket protein som migrerer med nsp9, noe som bekrefter vår konklusjon om at NiRAN og N-selektiv dannelse av kovalente nsp9-NMP-addukter .Det terminale primære aminet til den N-terminale Asn (posisjon 3825 i pp1a/pp1ab).Denne konklusjonen støttes også av eksperimenter som bruker nsp9-konstruksjonen, som inneholder en eller to ekstra rester ved N-terminalen.I begge tilfeller ble NiRAN-mediert UMPylering av nsp9 opphevet (SI-vedlegg, figur S7).Deretter produserte vi et protein med en eller to Asn-rester slettet fra 3825-NNEIMPK-3832-peptidsekvensen ved N-terminalen til nsp9.I begge tilfeller ble nsp9 UMPylering fullstendig blokkert (figur 5B), noe som ga ytterligere bevis på at den virkelige nsp9 N-terminalen fungerer som en NMP-reseptor.
Den proteolytiske behandlingen av nsp9 og rollen til N-terminale rester i nsp12-mediert UMPylering.(A) nsp9 UMPylering krever en fri nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 pre-inkuberes ved 30 °C i NMPyleringsdeteksjonsbuffer som inneholder UTP i nærvær eller fravær av rekombinant Mpro (nsp5-His6).Etter 3 timer, start NMPyleringsanalysen ved å tilsette nsp12-His6 som beskrevet i Materialer og metoder.Reaksjonen inneholdende nsp5-His6 (felt 1) og nsp9-His6 (felt 2) ble brukt som en kontroll.Etter 10 minutter ble reaksjonen avsluttet og reaksjonsblandingen ble separert ved SDS-PAGE.Proteinet ble farget med Coomassie Brilliant Blue (A, topp).Nsp7-11-His6-forløperen og det bearbeidede produktet som er et resultat av nsp5-His6-mediert spaltning er vist til høyre.Vær oppmerksom på (på grunn av deres lille størrelse) at nsp7 og nsp11-His6 ikke kan påvises i denne gelen, og reaksjonen er supplert med nsp5-His6 (bane 1 og 4; posisjonen til nsp5-His6 er indikert med en hel sirkel) eller nsp9-His6 (bane 2) inneholder en liten mengde MBP (angitt med åpne sirkler) som gjenværende urenheter fordi de uttrykkes som MBP-fusjonsproteiner (SI vedlegg, tabell S1).(B) Nsp9-His6-varianten mangler en eller to N-terminale Asn-rester (restnummerering i henhold til posisjonen i pp1a/pp1ab) og renses og inkuberes med nsp12-His6 og [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE farget med Coomassie er vist øverst, B, den tilsvarende autoradiografen er vist nederst.Posisjonen til molekylvektsmarkøren (i kilodalton) vises til venstre.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale konserverte rester ble erstattet med Ala eller Ser, og samme mengde protein ble brukt i den nsp12-His6 medierte UMPyleringsreaksjonen.Reaksjonsproduktene ble separert ved SDS-PAGE og farget med Coomassie Brilliant Blue (C, øverst), og radiomerket nsp9-His6 ble påvist ved fosforescensavbildning (C, midten).Ved å bruke villtype (wt) protein som referanse (sett til 100%), ble den relative NMPyleringsaktiviteten (gjennomsnitt ± SEM) beregnet fra tre uavhengige eksperimenter.(D) Virustitere i pl-cellekultursupernatanten av Huh-7-celler infisert med HCoV-229E villtype Huh-7-celler, og mutanter som bærer utpekte aminosyresubstitusjoner i nsp9 ble bestemt ved plakkanalyse.Den replikasjonsmangelfulle RdRp-motiv C dobbeltmutanten DD4823/4AA ble brukt som en negativ kontroll.
N-terminalen til nsp9 (spesielt posisjon 1, 2, 3 og 6) er svært bevart blant medlemmer av underfamilien Orthocoronavirinae (SI vedlegg, figur S6).For å studere den mulige rollen til disse restene i nsp12-mediert nsp9 NMPylering, ble to påfølgende Asn-rester ved N-terminalen av nsp9 erstattet med Ala eller Ser (alene eller i kombinasjon).Sammenlignet med villtype nsp9, resulterte erstatning av N3825 med Ala eller Ser i mer enn en to ganger reduksjon i nsp12-mediert UMPylering (figur 5C).I samsvar med vår konklusjon om at NMPylering forekommer ved det N-terminale primære aminet i stedet for sidekjeden til den N-terminale resten, observerte vi betydelig gjenværende NMPylering med erstatning av N3825A og N3825S.Interessant nok, hvis den andre Asn erstattes av Ala eller Ser, reduseres nsp9 UMPylering sterkere (mer enn 10 ganger), mens erstatning av Ala i posisjonene 3, 4 og 6 har bare en moderat effekt på nsp9 UMPylering (Figur 2) ).5C).Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av ATP, CTP eller GTP (SI vedlegg, figur S8).Samlet indikerer disse dataene nøkkelrollen til N2826 (posisjon 2 i nsp9) i nsp9 NMPylering.
For å få ytterligere bevis på den funksjonelle korrelasjonen mellom N-terminalen til nsp9 og NMPylering, utførte vi en multippelsekvensjustering (MSA) av nsp9-sekvensen til Coronavirus-familien (varierende mellom 104 og 113 rester) (SI vedlegg, figur S6).Totalt, i 47 (kjente og antatte) arter av 5 slekter av Orthocoronavirinae-underfamilien som infiserer forskjellige pattedyr, fugler og reptilverter, ble bare 8 rester totalt funnet å være invariante.De mest omfattende endringene, inkludert slettinger og innsettinger, ble observert i syklusene mellom de sekundære strukturelementene til nsp9, som bestemt av tidligere strukturelle studier (26 ??28).Fem invariante rester ble funnet i β-strengen og α-helixen til den C-terminale delen av nsp9.Tre invariante rester utgjør NNE-motivet til N-terminalen til nsp9.Det avsløres at den andre Asn av dette motivet er den eneste invariante resten, som også deles av den hypotetiske nsp9 til det fjernt beslektede froskekoronaviruset, og representerer Microhyla letovirus 1-arten i underfamilien Letovirinae av Alphaletovirus.Bevaring av rester i nsp9-sekundære strukturelementer kan rasjonaliseres av strukturelle hensyn for å opprettholde folding eller kjente RNA-bindende egenskaper.Dette resonnementet ser imidlertid ikke ut til å gjelde for bevaring av NNE, og før denne studien var arten av begrensningene som begrenser variasjonen av tripeptidsekvensen fullstendig skjult.
For å bestemme viktigheten av nsp9-NMPylering og NNE-konservering i koronavirusreplikasjon, produserte vi HCoV-229E-mutanter, som bærer enkle eller doble substitusjoner av nsp9 N-terminale rester, noe som indikerer at nsp9 NMPylering er skadelig in vitro.Før vi starter prøver vi å svare på spørsmålet om disse substitusjonene (nær nsp8|9-spaltingsstedet) påvirker den proteolytiske behandlingen av den C-terminale pp1a-regionen.Et sett med nsp7-11 polyproteinkonstruksjoner inneholdende tilsvarende substitusjoner ved N-terminalen av nsp9 ble produsert i E. coli og kuttet med rekombinant Mpro.Den proteolytiske spaltningen av de fire stedene (inkludert det nsp9-flankerende stedet) påvirkes ikke signifikant av noen introduserte substitusjoner (SI-vedlegg, figur S9), unntatt strukturelle endringer i disse proteinene som forstyrrer Mpro-mediert nsp8|9-spalting (eller annet) nettsted.
Huh-7-celler ble transfektert med genom-lengde HCoV-229E RNA, som koder for Ala- eller Ser-substitusjoner i de konserverte NNE-tripeptidene (N3825, N3826 og E3827) ved nsp9 N-terminalen, noe som viser at de fleste av mutasjonene er dødelige.Vi var i stand til å redde viruset ved å erstatte Ser eller Ala av den N-terminale Asn (N2835A eller N2835S), men klarte ikke å gjenopprette viruset med andre enkle og doble mutasjoner i NNE-sekvensen (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figur 5D).
Disse resultatene indikerer at replikasjonen av koronavirus i vevskultur er begrenset (samme eller lignende), noe som begrenser den naturlige mutasjonen av nsp9 NMPyleringssteder i kroppen, og støtter nøkkelrollen til denne responsen i livssyklusen til koronavirus.
I det siste settet med eksperimenter produserte vi C-terminal His6-merket SARS-CoV-2 nsp12 og nsp9, og to mutante former av nsp12 i E. coli.De aktive stedsrestene i NiRAN- og RdRp-domenene ble henholdsvis Bruk Ala i stedet (Figur 6A og SI vedlegg, Tabell S2).K4465 i SARS-CoV-2 nsp12 tilsvarer K4135 i HCoV-229E (SI-vedlegg, figur S2), som viste seg å være nødvendig for NiRAN-aktivitet og HCoV-229E-replikasjon (Figur 3D og E).Denne resten tilsvarer også den arterielle virus-EAV nsp9 K94-resten, som tidligere har vist seg å være nødvendig for NiRAN selv-UMPylering/selv-GMPylering (16).Som vist i figur 6B, har SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferaseaktivitet ved å bruke nsp9 som et substrat, mens nsp12_K4465A-aktive setemutanten er inaktiv.Den doble substitusjonen i den karakteristiske SDD-sekvensen til RdRp-motiv C påvirker ikke UMP-transferaseaktivitet (Figur 6B), noe som indikerer at RdRp-aktivitet ikke har noen direkte effekt i nsp9 UMPylering.Lignende data ble oppnådd ved bruk av CTP, GTP og ATP (SI vedlegg, figur S10).Oppsummert indikerer disse dataene at NiRAN-mediert nsp9 NMPylering har en konservativ aktivitet i koronavirus som representerer forskjellige slekter av ortocoronavirus-underfamilien.
SARS-CoV-2 nsp12-mediert NMPylering av nsp9.(A) Coomassie-farget SDS-polyakrylamidgel som viser det rekombinante proteinet brukt i NMPyleringstesten.Som en kontroll ble et mutantprotein med aktiv stedsubstitusjon i NiRAN-domenet (K4465A) og RdRp-domenet (DD5152/3AA) av SARS-CoV-2 nsp12 brukt.Restnummerering er basert på posisjon i pp1ab.(B) Autoradiograf av UMPyleringsdeteksjon ved bruk av nsp9-His6 og [α-32P]UTP som substratet til nsp12-His6 (villtype [wt] og mutant).Molekylmassen (i kilodalton) til det merkede proteinet er vist til venstre.
NiRAN-domener er generelt bevart i Nidovirales (16), noe som indikerer at de katalyserer enzymatiske reaksjoner som er avgjørende for replikering av Nidovirus.I denne studien var vi i stand til å bevise at NiRAN-domenet til koronaviruset overfører NMP (generert fra NTP) til nsp9, et mystisk RNA-bindende protein involvert i virusreplikasjon (26 ?? 29 ), for å bestemme det som et naturlig mål og partner av coronavirus RTC.
NiRAN-domenet deler tre sekvensmotiver (AN, BN og CN), som inneholder et svært lite antall rester som er bevart i alle familier i den monofyletiske, men svært differensierte Nidovirales-rekkefølgen (8, 16).Nyere studier har vist at de er strukturelt relatert til en stort sett ukarakterisert familie av proteinkinase-lignende proteiner, som opprinnelig ble kalt SelO-familien (17, 19, 22, 30, 31).SelO-relaterte proteiner har kinasefolder, men mangler flere konserverte aktive seterester i klassiske kinaser (22, 32).Basert på omvendt orientering av ATP-molekyler bundet til det aktive stedet og stabilisert ved spesifikke interaksjoner, ble SelO antatt og deretter bekreftet å overføre AMP (i stedet for fosfat) til proteinsubstratet (22), mens et annet bakterielt SelO-lignende protein YdiU har nylig vist seg å katalysere den kovalente bindingen av UMP til Tyr og His-rester av forskjellige proteinsubstrater (33).
For å bekrefte og utvide forutsigelsen av de antatte aktive stedsrestene til coronavirus NiRAN-domenet, brukte vi biokjemiske og omvendt genetikkmetoder for å utføre mutasjonsanalyse på koronaviruset nsp12 (Figur 3D og E og SI vedlegg, figur S3 og tabell) S1â S4).Dataene viser at erstatningen av HCoV-229E K4135, R4178 og D4280 med Ala eliminerer in vitro NMP-transferaseaktivitet og virusreplikasjon i cellekultur (Figur 3D og E og SI vedlegg, Figur S3), og støtter deres tilstedeværelse i NTP γ-fosfat ( K4135, R4178) og koordineringen av metallioner på det aktive stedet (D4280).E4145A-substitusjonen av det konserverte Glu i området til fuglereirviruset som er spådd å stabilisere K4135 (17)-posisjonen, ble vist å eliminere viral replikasjon, men overraskende nok ble aktiviteten beholdt i in vitro NMPyleringsanalysen (Figur 3D og E og SI vedlegg, figur S3 og tabeller S1–S4).En lignende observasjon ble gjort da den tilsvarende substitusjonen ble introdusert i YdiU-homologen til Salmonella typhimurium (E130A) (33).Til sammen støtter disse dataene den regulatoriske funksjonen til denne konserverte resten i stedet for den katalytiske funksjonen.
Å erstatte den konserverte Phe-resten (F4281A) innenfor nestovirusområdet i HCoV-229E NiRAN-domenet (8) resulterte i en reduksjon i NMPyleringsaktivitet in vitro og en signifikant reduksjon i virusreplikasjon i cellekultur (Figur 3D, E og SI) vedlegg, figur S3).Dataene er i samsvar med den viktige regulatoriske funksjonen til denne resten, slik som den homologe DFG-motivet Phe-resten vist tidligere.I klassiske proteinkinaser er det en del av Mg2+-bindingssløyfen og hjelper til med å sette sammen og regulere ryggraden???Nødvendig for effektiv katalytisk aktivitet (32, 34).Å erstatte Ala og Arg med K4116-rester (i preAN-motivet), eliminerte henholdsvis viral replikasjon og hadde, som forventet, forskjellige effekter på NMP-transferaseaktivitet in vitro, avhengig av aminosyresidekjeden som ble introdusert (Figur 3D og E og SI vedlegg , figur S3).De funksjonelle dataene stemmer overens med strukturinformasjonen, noe som indikerer at denne resten har etablert en interaksjon med ATP-fosfat (17).I NiRAN-domenet til andre nestede virusfamilier er posisjonen til HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 okkupert av Lys, Arg eller His (8), noe som indikerer at den funksjonelle begrensningen av denne spesifikke resten har blitt avslappet.Substitusjonen av D4188A og D4283A eliminerer eller reduserer enzymaktiviteten sterkt og eliminerer virusreplikasjon (figur 3).Disse to restene er bevart i de fleste (men ikke alle) nestede virus (8), noe som indikerer en viktig familiespesifikk, men muligens ikke-katalytisk funksjon.Ala-substitusjoner av flere andre Lys- og Asp-rester (K4113A, D4180A, D4197A og D4273A) som ikke er konservert i Coronaviridae eller andre Nestioviridae-familier (8) ble brukt som kontroller.Som forventet er disse substitusjonene stort sett tolerable, med en liten reduksjon i enzymaktivitet og viral replikasjon i noen tilfeller (figur 3 og SI vedlegg, figur S3).Totalt sett er koronavirusmutagenesedataene veldig konsistente med selv-GMP og omvendt genetikkdata til EAV NiRAN-RdRp (16), der EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortolog) rest K94 (tilsvarende HCoV-229E K4135) er viktige funksjoner), R124 (tilsvarende R4178), D132 (tilsvarende D4188), D165 (tilsvarende D4280), F166 (tilsvarende F4281).I tillegg er HCoV-229E-mutagenesedataene i samsvar med og utvidet fra de tidligere rapporterte SARS-CoV omvendt genetikkdata (16), like svært like de som er observert for det tilsvarende CN-motivet Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. fenotype beskrevet -F219A og HCoV-229E_F4281A (Figur 3 D og E og SI vedlegg, Figur S3 og Tabell S1-S4).
Sammenlignet med EAV-ortologer (16), som har en klar preferanse for UTP og GTP (i selv-NMPyleringsreaksjonen), viser vår studie at coronavirus NiRAN-domenet (representert av HCoV-229E og SARS-CoV-2) kan være effektivt overført Alle fire NMP, selv om det er en liten preferanse for UMP (figur 1 og 3).Den relativt lave spesifisiteten til det spesifikke NTP-kosubstratet er i samsvar med den nylig rapporterte SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkomposittstrukturen, der ADP-Mg2+ binder seg til det aktive stedet til NiRAN, men ikke med adenindelen. av dannelsen av spesifikke interaksjoner (17).I vår studie har typen nukleotid som brukes i NMPyleringsreaksjonen ingen differensiell effekt på aktiviteten til mutantproteinet (SI-vedlegg, figur S3), noe som indikerer at ingen av disse restene er nært knyttet til bindingen til en spesifikk nukleobase.Det strukturelle grunnlaget og den potensielle biologiske betydningen av de forskjellige NTP-kosubstratpreferansene observert i NiRAN-domenene til koronavirus og arterielle virus gjenstår å studere;de kan være sanne eller kan skyldes begrensningene i deres respektive studier.Foreløpig kan det ikke utelukkes at den potensielle NMPylatoraktiviteten til det arterielle viruset NiRAN-domenet (sammenlignet med den tidligere karakteriserte selv-NMPyleringsaktiviteten) har en annen co-substratpreferanse, tatt i betraktning at likheten mellom det arterielle og koronaviruset NiRAN-domenet er på grensen.Sekvensbasert Sammenlign (16).Sammenlignet med pseudokinasen SelO, som bruker Mg2+ som en kofaktor, er aktiviteten til koronavirus og arterielt virus NiRAN avhengig av Mn2+ (16) (Figur 3C og SI vedlegg, Figur S1).Mn2+-avhengigheten og den åpenbare preferansen for UTP er et uvanlig trekk ved protein-NMPylatorer, og har først nylig blitt bekreftet i YdiU-proteinet til Salmonella typhimurium, som katalyserer den strenge Mn2+-avhengige proteinchaperonen UMPylering for å beskytte cellene mot stressinduksjon Cell ATP pool ( 33).
Den nylig beskrevne strukturelle likheten mellom coronavirus NiRAN-domenet og cellulære proteinkinaser (17, 19) gir ytterligere støtte for NiRANs evne til å kovalent koble NMP til andre proteiner vi har rapportert i denne studien.Vi fokuserte søket etter mulige NiRAN-mål på proteinene kodet av HCoV-229E ORF1a, som er kjent for å direkte eller indirekte hjelpe RTCs ORF1b-kodede replikase (12, 35).Eksperimentene våre gir avgjørende bevis for effektiv og spesifikk NMPylering av nsp9 (figur 2).Hvis målproteinet brukes i et molart overskudd som er 8 til 10 ganger høyere enn enzymet (nsp12), bekreftes det at nsp9 er fullstendig (mono)NMPisert (Figur 4).Vi konkluderte med at interaksjonen mellom nsp12 og nsp9 er kortvarig og ikke vil danne et stabilt kompleks med nsp9 (i fravær av andre RTC-underenheter).Denne konklusjonen støttes av proteininteraksjonsstudier på SARS-CoV-proteomet (35).MS-analyse identifiserte det primære aminet til den N-terminale resten av nsp9 som NMPyleringsstedet (SI vedlegg, figur S5).Dannelsen av fosforamidatbindingen og den N-terminale aminogruppen skiller den NiRAN-medierte NMPyleringsaktiviteten fra den Pseudomonas syringae SelO-medierte AMPyleringsreaksjonen, som katalyserer dannelsen av O-bundet AMP ved Ser-, Thr- eller Tyr-rester Peptidaddukt ( 22), og S. typhimurium YdiU danner O-koblede (med Tyr) og N-koblede (med His) peptid-UMP-addukter.Den begrensede informasjonen som er tilgjengelig om SelO-familien av proteiner indikerer at medlemmer av denne store proteinfamilien er svært forskjellige i dannelsen av peptid-NMP-addukter.Dette er en interessant observasjon som fortjener videre studier.
Dataene innhentet i denne studien førte til at vi antok at NMPylering av nsp9 krever en fri N-terminal.I sammenheng med viral replikasjon vil dette bli gitt av den proteolytiske spaltningen av nsp8|nsp9-prosesseringsstedet i replikasepolyproteinet pp1a mediert av Mpro og pp1ab.I de fleste koronavirus er forskjellen mellom dette spesifikke stedet (VKLQ|NNEI i HCoV-229E) og alle andre koronavirus Mpro-spaltingssteder Asn (i stedet for en annen liten rest, som Ala, Ser eller Gly) opptar P1â???Plassering (36).Peptidspaltningsdataene oppnådd i de tidlige studiene viste at spaltningseffektiviteten til nsp8|nsp9-stedet var lavere enn for andre steder, noe som indikerer at 1) dette spesifikke stedet kan ha en regulerende rolle i den rettidig koordinerte behandlingen av C-terminalen pp1a-regionen, eller 2) a Rollen til den spesielle konserverte nsp9 N-terminalen i virusreplikasjon (37).Dataene våre (figur 5A) viste at den rekombinante formen av nsp9 som bærer den virkelige N-terminale sekvensen, effektivt ble NMPisert av nsp12.Den N-terminale flankerende sekvensen ble fjernet av faktor Xa (nsp9-His6; SI vedlegg, tabell S1) eller Mpro-mediert spalting (nsp7-11-His6; figur 5A og SI vedlegg, tabell S1).Det er viktig at den ukuttede nsp9-holdige forløperen nsp7-11-His6 viste motstand mot NMPylering av nsp12, noe som er i samsvar med våre data, noe som indikerer at nsp9-NMP-adduktet dannes gjennom det N-terminale primære aminet (SI-vedlegg, figur S5) .For å få en dypere forståelse av NiRAN-substratspesifisitet, fokuserte vi deretter på de tilstøtende N-terminale restene av nsp9.I fravær av andre proteiner er de strukturelt fleksible, og forhindrer dem i å bli oppdaget i den umerket form av nsp9 (26 28, 38), noe som indikerer deres begrensede naturlige variasjon. Dette skyldes den viktige sekvensspesifikke (ikke sekundær strukturrelatert) funksjonen til det nsp9 N-terminale fragmentet.Ala-substitusjoner av konserverte rester i denne regionen (figur 5C og D og SI vedlegg, figur S8) avslører at N3826 er avgjørende for nsp9 NMPylering in vitro, mens N3825A og E3827A substitusjoner fører til en reduksjon i NMPylering, mens M3829A og P3830A ikke gjør substitusjoner .Åpenbart påvirke nsp9 NMPylering.Selv om substitusjonen av N-terminal Asn (N3825A, N3825S) bare har en moderat effekt på nsp9 NMPylering og virusreplikasjon i cellekultur (figur 5C og D), er slettingen av en Asn-restsekvens fra det N-terminale 3825-NN-dipeptidet viste seg å være Det er dødelig for virus, noe som indikerer at en Asn-rest er nødvendig før en annen rest ved N-terminalen, fortrinnsvis Asn, selv om det ser ut til at substitusjon av lignende rester delvis kan tolereres (Figur 5B, C og D).Vi konkluderer med at 3825-NN-dipeptidet, spesielt den konserverte og essensielle N3826-resten innenfor koronavirusområdet (SI vedlegg, figur S6), sikrer riktig binding og orientering av nsp9 N-terminalen i det aktive stedet til NiRAN.
Å erstatte Ala (E3827A) med den konserverte Glu fra alle underfamilier beholder nsp9 NMPylering in vitro, men er dødelig for virus i cellekultur (figur 5C og D), noe som indikerer tilleggsfunksjonen til denne resten, for eksempel i nøkkelinteraksjoner (NMPylert eller umodifisert ) nsp9 N-terminal og andre faktorer involvert i virusreplikasjon.Nsp9-mutasjoner påvirket ikke den proteolytiske prosessen til nsp9 eller noen tilstøtende nsps (39) (SI-vedlegg, figur S9), noe som indikerer at de dødelige fenotypene til flere observerte nsp9-mutasjoner ikke var forårsaket av dysreguleringen av det C-proteolytiske prosessterminale pp1a-området .
Dataene ovenfor gir bevis for at etter Mpro-mediert behandling av nsp8|9-spaltingssetet i pp1a/pp1ab, kan N-terminalen til nsp9 UMPyleres (eller delvis modifiseres med en annen NMP).I tillegg førte den utmerkede bevaringen av N-terminalen til nsp9 (inkludert de entall og invariante Asn-restene i koronavirusfamilien) og de omvendte genetikkdataene oppnådd i denne studien (figur 3E og 5D) oss til å konkludere med at den beskrevne nsp9 NMPyleringen er biologisk relatert og avgjørende for replikering av koronavirus.De funksjonelle konsekvensene av denne modifikasjonen gjenstår å studere, for eksempel angående den tidligere beskrevne (ikke-spesifikke) nsp9 (umodifisert form) RNA-bindingsaktivitet (2628).N-terminal NMPylering kan også påvirke interaksjonen av nsp9 med protein- eller RNA-substrater eller dannelsen av forskjellige fire-nivåsammenstillinger.Disse har blitt observert i strukturelle studier og har blitt bekreftet å være funksjonelt relatert til koronavirusreplikasjon, men spesielt i fravær av I tilfellet med denne modifikasjonen (26-âââ29, 40).
Selv om målspesifisiteten til coronavirus NiRAN-domenet fortsatt må karakteriseres mer detaljert, viser dataene våre at proteinmålspesifisiteten til coronavirus NiRAN-domenet er veldig smal.Selv om konservering av nøkkelaktive seterester (8, 16) i NiRAN-domenet til alle nidovirusfamilier sterkt støtter aktiviteten til den konserverte NMPylatoren av disse proteinene, gjenstår identiteten til de substratbindende lommerestene til dette domenet. Konservering og konservering skal karakteriseres , og kan variere mellom forskjellige familier av Nidovirales-formål.På samme måte har de relevante målene for andre nestede virus ennå ikke blitt bestemt.De kan være eksterne ortologer av nsp9 eller andre proteiner, fordi sekvensene utenfor de fem replikasedomenene som generelt er konservert i nestede virus er mindre konserverte (8), inkludert genomarrayen mellom Mpro og NiRAN, blant dem er nsp9 lokalisert i koronavirus.
I tillegg kan vi foreløpig ikke utelukke muligheten for at NiRAN-domenet har flere (inkludert cellulære) mål.I dette tilfellet er det verdt å nevne at bakteriehomologene i dette nye proteinet NMPylatorer (NMPylatorer) (30, 31) ser ut til å ha "masterregulatorer"?NMP modulerer en rekke cellulære proteiner for å regulere eller eliminere deres nedstrømsaktiviteter, og spiller derved en rolle i en rekke biologiske prosesser, slik som cellulær stressrespons og redokshomeostase (22, 33).
I denne studien (figur 2 og 4 og SI-vedlegg, figur S3 og S5), var vi i stand til å bevise at nsp12 overførte UMP (NMP)-delen til en enkelt (konservert) posisjon i nsp9, mens andre proteiner ikke ble modifisert i brukt Under forholdene støttes veldefinert (i stedet for løs) substratspesifisitet.I samsvar med dette, sammenlignet med N-terminal nsp9 NMPylering, er nsp12s egen NMPyleringsaktivitet svært lav, dets deteksjon krever lengre autoradiografi eksponeringstid, og en 10 ganger økning i nsp12 konsentrasjon brukes.I tillegg klarte ikke MS-analysen vår å gi bevis for NMPylering av nsp12, noe som antyder at selv-NMPylering i NiRAN-domene (i beste fall) er en sekundær aktivitet.Det bør imidlertid bemerkes at andre studier har gitt foreløpige bevis på at selv-AMPyleringsstatusen til bakteriell NMPylator kan kontrollere deres NMPyleringsaktivitet på andre proteinsubstrater (22, 33).Derfor er det nødvendig med mer forskning for å undersøke de mulige funksjonelle effektene av selv-NMPyleringsaktiviteter rapportert for EAV nsp9 (16) og coronavirus nsp12 (denne studien), inkludert den foreslåtte chaperone-lignende effekten på foldingen av det C-terminale RdRp-domenet ( 16) ).
Tidligere har flere hypoteser angående de mulige nedstrømsfunksjonene til det nidovirale NiRAN-domenet blitt vurdert, inkludert RNA-ligase, RNA-avkortet guanylattransferase og proteinprimingsaktivitet (16), men ingen av dem er kompatible med de tilgjengelige nedstrømsfunksjonene.Informasjonen innhentet i følgende posisjoner er nøyaktig samme tid uten å gjøre ytterligere forutsetninger.Dataene oppnådd i denne studien er mest konsistente med (men kan ikke bevise) at NiRAN-domenet er involvert i initieringen av proteinindusert RNA-syntese.Det ble tidligere antatt at funksjonen til NiRAN-domenet i 5??²-RNA-kapping eller RNA-ligeringsreaksjoner påvirkes ikke av disse og støtte for andre data.Derfor anses for eksempel det aktive stedet til NiRAN å involvere den konserverte Asp som en generell base (D252 i Pseudomonas syringae SelO; D4271 i HCoV-229E pp1ab; D208 i SARS-CoV-2 nsp12) (SI vedlegg, figur 2) ).S2) (17, 22, 33), mens katalysen i den ATP-avhengige RNA-ligase og RNA-kappingsenzymet utføres av det kovalente enzymet-(lysyl-N)-NMP-mellomproduktet, som involverer en ikke-endret Lys-rest ( 41).I tillegg motsetter den bemerkelsesverdige sekvensbaserte spesifisiteten til koronaviruset NiRAN for konserverte proteinmål og den avslappede spesifisiteten for NTP-co-substrater (foretrekker UTP) NiRAN-mediert avdekningsenzym eller RNA-ligase-lignende funksjoner.
Det er åpenbart nødvendig med mye ekstra arbeid for å verifisere og, hvis bevist, utdype den mulige rollen til nsp9-UMP (nsp9-NMP) i proteinindusert RNA-syntese, noe som vil koble sammen flere interessante, men (så langt) rapporter tidligere rapportert .Isolerte observasjoner.For eksempel har det blitt bestemt at enden av den negative tråd-RNA-en til koronavirus starter med en oligo(U)-tråd (42, 43).Denne observasjonen er i samsvar med ideen om at syntesen av negativ-tråd RNA initieres ved å binde den UMPylerte formen av nsp9 til poly(A) halen (triggere), som kan fremmes av dens RNA-binding. Aktiviteten og/eller interaksjonen med et annet RTC-protein.UMP-delen levert av nsp9 kan deretter brukes som en "primer" for nsp7/8/nsp12-mediert oligouridylering, ved å bruke 3??²-poly(A) halen i det genomiske RNA eller en annen oligo (A)-holdig sekvens fungerer som en mal, lik mekanismen etablert for picornavirus VPg-proteinet (44).Hva om forslaget er «ikke-normativt»????Starten av (proteinindusert) negativ-tråd RNA-syntese gir en kobling til observasjonene, noe som indikerer at koronavirus-negativ-tråd RNA har UMP (i stedet for UTP) på slutten (42), som anses å indikere at nukleinsyre Dicer spalter enden som er fosforylert av en ukjent uridinspesifikk endonuklease.Hvis bekreftet, kan denne nukleinsyrehydrolytiske aktiviteten bidra til å frigjøre den oligomere UMPylerte formen av nsp9 fra den 5 ² enden av den begynnende negative tråden.Den mulige rollen til nsp9 i proteinpriming stemmer også overens med tidligere omvendt genetikkstudier, som har vist at nsp9 (og nsp8) interagerer kritisk og spesifikt med det konserverte cis-virkende RNA-elementet nær 3-enden av koronavirusgenomet.45).Ifølge denne rapporten kan disse tidligere observasjonene nå undersøkes på nytt og utvides gjennom videre forskning.
Oppsummert bestemte dataene våre den spesifikke aktiviteten til en proprietær nestet virusenzym-tag koblet til RdRp ved N-terminalen.I koronavirus brukes denne nyoppdagede NiRAN-medierte UMPylator/NMPylator-aktiviteten til å stole på Mn2+ og tilstøtende Asn-rester og forårsake dannelse av (lavenergi) fosforamidatbindinger med det N-terminale primære aminet.Gjennom Mpro-mediert spaltning ved nsp8|9-spaltningsstedet kan nsp9-målet brukes til NMPylering, noe som indikerer den funksjonelle koblingen mellom proteasen og NiRAN-domenet, som strekker seg til RdRp.Bevaring av nøkkelrester i det aktive nsp12 NiRAN-stedet og nsp9-målet, kombinert med data hentet fra to koronavirus inkludert SARS-CoV-2, gir sterke bevis på at nsp9 NMPylering er et koronavirus. Konservative egenskaper er også et nøkkeltrinn i virusreplikasjon.De tilgjengelige dataene fører oss til å konkludere med at den spesifikke rollen til NMPylert form av nsp9 i proteinindusert RNA-syntese er et rimelig scenario for koronavirus og andre nestede virus, og NiRAN kan også målrette mot andre uidentifiserte proteiner.Reguler viruset.Vertsinteraksjon.Hvis det bekreftes, vil involvering av proteinprimere i viral RNA-syntese øke sekvensaffiniteten til Mpro/3CLpro- og RdRp-domenene mellom den tidligere påviste koronaviruset og picornavirus-lignende supergruppen (9), som nå er blitt forent i de nylig etablerte Pisonivirites ( 46) i kategorien.
Våre data viser også at de grunnleggende, selektive og konservative enzymaktivitetene identifisert i denne studien kan brukes som mål for antivirale legemidler.Forbindelser som forstyrrer bindingen (og påfølgende modifikasjonen) av den konserverte nsp9 N-terminalen i det aktive stedet til NiRAN kan utvikles til effektive og allsidige antivirale legemidler, egnet for behandling av animalske og menneskelige koronavirus fra forskjellige (under)slektsinfeksjoner , inkludert SARS-CoV-2 og Midtøsten Respiratory Syndrome Coronavirus.
Den kodende sekvensen til koronavirusproteinet produsert i denne studien ble amplifisert ved RT-PCR ved bruk av RNA isolert fra Huh-7 infisert med HCoV-229E eller Vero E6 infisert med SARS-CoV-2, og satt inn ved bruk av standard kloningsprosedyrer.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) eller pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresjonsvektor (SI vedlegg, tabeller S1 og S2).Enkeltkodonsubstitusjoner ble introdusert ved PCR-basert stedsrettet mutagenese (48).For å produsere MBP-fusjonsproteinet ble E. coli TB1-celler transformert med den passende pMAL-c2-plasmidkonstruksjonen (SI vedlegg, tabell S1).Fusjonsproteinet ble renset ved amyloseaffinitetskromatografi og spaltet med faktor Xa.Deretter ble det C-terminale His6-merkede proteinet renset ved Ni-immobilisert metallaffinitetskromatografi (Ni-IMAC) som tidligere beskrevet (49).For å produsere ubiquitin-fusjonsproteinet brukte E. coli TB1-celler den passende pASK3-Ub-CHis6-plasmidkonstruksjonen (SI-vedlegg, tabeller S1 og S2) og pCGI-plasmid-DNA som koder for ubiquitin-spesifikk C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transformasjon (47).Det C-terminale His6-merkede koronavirusproteinet ble renset som tidligere beskrevet (50).
Selv-NMPyleringstesten av HCoV-229E nsp12-His6 ble utført som beskrevet i EAV nsp9 (16).Kort fortalt inneholder nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfonsyre (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, 25 µM buffer. spesifisert NTP og 0,17 µM matchet [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ved 30 °C i 30 minutter.I alle andre (standard) NMPyleringsanalyser av nsp12-mediert nsp9 NMPylering, justeres reaksjonsbetingelsene som følger: nsp12-His6 (0,05 µM) og nsp9-His6 (4 µM) i nærvær av 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indikerte NTP og 0,17 µM matchet [a32-P]NTP.Etter inkubering i 10 minutter ved 30°C ble reaksjonsprøven blandet med SDS-PAGE prøvebuffer: 62,5 mM tris(hydroksymetyl)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glyserol og 0,005 % bromfenol blå.Proteinet ble denaturert ved oppvarming ved 90 °C i 5 minutter og separert med 12 % SDS-PAGE.Gelen fikseres og farges med Coomassie Brilliant Blue-løsning (40 % metanol, 10 % eddiksyre, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250), avfarges og eksponeres for en fosforescerende bildeskjerm i 20 timer (for å oppdage nsp12 fra NMPylering) eller (maksimalt) 2 timer (for å vurdere nsp9 NMPylering).En Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) ble brukt til å skanne skjermen og ImageJ ble brukt til å analysere signalintensiteten.
For MS-analyse ble 1 µM nsp12-His6 og 10 µM nsp9 (uten heksahistidin-tag) brukt i NMPyleringsanalyse (SI vedlegg, tabell S1) og den økte konsentrasjonen på 500 µM UTP og GTP ble brukt.Avhengig av deres konsentrasjon og forventet proteinkvalitet, ble et Waters ACQUITY H-klasse HPLC-system utstyrt med en MassPrep-kolonne (Waters) brukt til å avsalte 1 til 10 µL bufrede proteinløsninger online.Det avsaltede proteinet elueres inn i elektrosprayionekilden til Synapt G2Si massespektrometer (Waters) gjennom følgende gradient av buffer A (vann/0,05 % maursyre) og buffer B (acetonitril/0,045 % maursyre), og kolonnetemperaturen er 60 ° C og en strømningshastighet på 0,1 ml/min: eluering isokratisk med 5 % A i 2 minutter, deretter en lineær gradient til 95 % B innen 8 minutter, og oppretthold 95 % B i ytterligere 4 minutter.
Positive ioner med et masseområde på 500 til 5000 m/z detekteres.Glu-fibrinopeptid B måles hvert 45. sekund for automatisk massedriftskorreksjon.Bruk MassLynx instrumentprogramvare med MaxEnt1-utvidelse for å dekonvolvere gjennomsnittsspekteret etter å ha trukket fra grunnlinjen og utjevningen.
UMPylert HCoV-229E nsp9 ble fordøyd ved å tilsette sekvenseringsgrad modifisert trypsin (Serva) og inkubert over natten ved 37 °C.En Chromabond C18WP spinnkolonne (delenummer 730522; Macherey-Nagel) ble brukt til å avsalte og konsentrere peptidene.Til slutt ble peptidet oppløst i 25 µL vann, som inneholdt 5 % acetonitril og 0,1 % maursyre.
Prøvene ble analysert av MS ved bruk av et Orbitrap Velos Pro massespektrometer (Thermo Scientific).Det ultimate nanoâ HPLC-systemet (Dionex), utstyrt med en tilpasset endemontert 50 cm??75 μm C18 RP kolonne pakket med 2,4 μm magnetiske perler (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Koble til massespektrometeret online gjennom Proxeon nanospraykilden;injiser 6 µL trypsinfordøyelsesløsning i en 300 µm indre diameter ×??1 cm C18 PepMap forkonsentrasjonskolonne (Thermo Scientific).Ved å bruke vann/0,05 % maursyre som løsningsmiddel, ble prøven automatisk fanget og avsaltet med en strømningshastighet på 6 µL/min.
Følgende gradienter av vann/0,05 % maursyre (løsningsmiddel A) og 80 % acetonitril/0,045 % maursyre (løsningsmiddel B) ble brukt for å oppnå separasjon av tryptiske peptider ved en strømningshastighet på 300 nL/min: 4 % B for 5 minutter, deretter 30 A lineær gradient til 45 % B i løpet av minutter, og en lineær økning til 95 % løsemiddel B innen 5 minutter.Koble den kromatografiske kolonnen til en nano-emitter av rustfritt stål (Proxeon), og spray eluenten direkte til den oppvarmede kapillæren til massespektrometeret ved å bruke et potensial på 2300 V. Undersøkelsesskanningen med en oppløsning på 60 000 i Orbitrap-masseanalysatoren er tilknyttet med minst tre data-MS/MS-skanninger, dynamisk utelukket i 30 sekunder, ved bruk av lineær ionefelle-kollisjonsindusert dissosiasjon eller høyere energi-kollisjonsdissosiasjon kombinert med orbitrap-deteksjon, er oppløsningen 7500.
Innleggstid: Aug-03-2021